RICERCA: QUANTO CONTA E QUANTO COSTA… Laboratorio di immunologia: esempio di un esperimento, finalità e stima dei costi

QUANTO COSTA L'ESPERIMENTO?

Un gruppo di individui è affetto da una malattia autoimmune. Il sistema immunitario - attivatosi per rispondere alla presenza di un agente estraneo (per esempio un virus) - non è più in grado “spegnersi”: la fisiologica reazione infiammatoria avviata per combattere un’infezione è così dirottata contro l'organismo stesso (self, proprio). Le conseguenze sono la deteriorazione e il malfunzionamento di specifici organi o distretti.

Le malattie definite “autoimmuni” sono caratterizzate da sintomi simili, ma possono essere provocate da cause diverse: capire le basi cellulari e molecolari di queste manifestazioni cliniche è perciò il primo passo per classificare la patologia, definire metodi diagnostici, prevedere l’evoluzione clinica e indicare possibili approcci terapeutici.

ATTIVITÁ DI LABORATORIO -  QUANTO COSTA L'ESPERIMENTO?

I ricercatori confrontano la composizione e l’attività dei globuli bianchi (leucociti) presenti nel sangue prelevato dai pazienti e di quello donato da individui sani; in particolare, analizzano le sottopopolazioni di leucociti presenti e le citochine prodotte. I risultati ottenuti forniscono indicazioni sulla patogenesi: se modificata nelle sue caratteristiche funzionali, la popolazione linfocitaria X arreca danno a un determinato organo; l’alterazione dei livelli della citochina Y determina la persistenza dei fenomeni infiammatori alla base della malattia autoimmune.

Per condurre questo studio i ricercatori ricorrono all’analisi citofluorimetrica: una metodologia che permette di esaminare un elevato numero di cellule del sangue in breve tempo, quantificando contemporaneamente più parametri per ogni singola cellula. La caratterizzazione dei diversi sottotipi di leucociti e delle loro funzioni, viene fatta saggiando i livelli di un ampio range di molecole di membrana (recettori) e di citochine. Data la normale variabilità fra gli individui, è essenziale studiare un alto numero di campioni di sangue. Solo in questo modo, infatti, si potranno ricavare risultati statisticamente significativi e porre le basi per l’avvio di uno studio clinico. 

Attività 1

Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico. Per avere dati significativi occorre analizzare almeno 50 individui malati e 20 sani. I campioni di sangue sono processati in giorni diversi in base alla disponibilità.

Reagenti e strumentazione: Soluzione Ficoll; provette; centrifuga a temperatura ambiente e centrifuga refrigerata

Tempo: 1 ora per un massimo di 5 campioni

Media costo: 800 euro per 70 campioni*

Attività 2

“Colorazione” delle cellule con anticorpi coniugati con molecole fluorescenti (fluorofori). Tali anticorpi riconoscono, legano ed “etichettano” specifiche sottopopolazioni di leucociti e, all’interno della cellula, specifiche citochine in via di produzione. Poiché ogni anticorpo è in grado di riconoscere un singolo recettore o una singola citochina, per poter analizzare ed interpretare correttamente i dati, è necessario utilizzare per ogni campione diverse combinazioni di anticorpi, ognuno di essi legato ad un fluoroforo diverso.

Se, per esempio, per ogni campione di sangue si vogliono analizzare 6 proteine diverse (fra recettori e citochine) bisognerà allora preparare almeno 12 provette da processare al citofluorimetro: 6 provette contenenti la combinazione scelta di anticorpi specifici per determinati recettori e/o citochine e 6 provette contenenti i rispettivi anticorpi di controllo.

Reagenti e strumentazione: Soluzioni per il trattamento delle cellule; anticorpi; centrifuga.

Tempo: 3 ore a colorazione (5 campioni alla volta)

Media costo 42.000 euro per 70 campioni (600 euro per campione di sangue). Il costo aumenta se si sceglie di saggiare un numero maggiore di citochine (e quindi si utilizza un numero maggiore di anticorpi).

Attività 3

L’intensità di fluorescenza è registrata mediante l’utilizzo del citofluorimetro a flusso. (Acquisizione dei dati). 

Tempo: circa 1 ora per campione di sangue

Strumentazione: Citofluorimetro a flusso

Attività 4

Analisi dei risultati ottenuti al citofluorimetro. La percentuale di cellule positive per un anticorpo che riconosce un recettore di membrana è indicativa del numero di cellule appartenenti a una specifica sottopopolazione cellulare, mentre l’intensità di fluorescenza relativa agli anticorpi che riconoscono le diverse citochine è indicativa della quantità delle diverse citochine prodotte.

Tempo circa 6 mesi per 70 campioni.

Attività 5

Interpretazione dei dati; stesura del manoscritto, revisione e pubblicazione dei risultati

Tempo: circa 8 mesi

Costo totale per l’esperimento

Reagenti:           42.800 euro*

Pubblicazione: 1.500 euro costi di editoria per la pubblicazione del lavoro

*I costi non includono quelli per la strumentazione base e la loro manutenzione. (Centrifuga refrigerata: 10:000 euro; citofluorimentro a flusso: 90.000 euro). Non sono, inoltre, considerati i Salari annuali per i ricercatori che conducono l’esperimento. Un esperimento di questo tipo è condotto in genere da un ricercatore post doc e un tecnico di laboratorio. I salari si stabiliscono in base ai curricula.

Ringraziamenti: le Dott.sse Rosa Molfetta e Helena Stabile e la Prof.ssa Rossella Paolini del laboratorio di Immunologia molecolare e Immunopatologia (Dipartimento Medicina Molecolare di Sapienza – Università) hanno fornito le informazioni necessarie alla stesura di questo articolo.

 

Glossario

Leucociti o globuli bianchi: cellule del sangue che includono i diversi sottotipi di linfociti e altre cellule coinvolte nella risposta immunitaria.


Laboratorio di biologia strutturale: esempio di un esperimento, finalità e stima dei costi   L'esperimento: È noto che una determinata proteina riveste un ruolo chiave nello sviluppo di una patologia. Per esempio, il malfunzionamento di una ipotetica proteina X (come un enzima o di un recettore di membrana) può inviare alla cellula istruzioni sbagliate, inducendole a proliferare senza sosta: un fenomeno associato allo sviluppo del cancro. Oppure, una sola mutazione della proteina che trasporta il cloro nelle cellule è causa di una grave malattia genetica, la fibrosa cistica.   Quanto conta ricercare? Conoscere la “forma” (struttura tridimensionale) che la proteina X assume per svolgere la propria attività biologica è essenziale per poter disegnare farmaci dalla struttura complementare, quindi in grado di legare X e bloccarne l’attività indesiderata (per saperne di più sull’importanza degli esperimenti di biologia strutturale leggi l’articolo Vita di una proteina: tra forma e funzione).   Attività: Il lavoro per stabilire la struttura della proteina X è complesso, richiede tempo, competenze specifiche molto avanzate e ha dei costi elevati. Il primo step consiste nella produzione, su larga scala, della proteina che poi, una volta purificata, subisce il processo di cristallizzazione. I cristalli ottenuti vengono quindi analizzati per mezzo del sincrotrone* - una macchina deputata alla produzione di raggi X da utilizzare per lo studio dei materiali e della struttura tridimensionale delle molecole.   QUANTO COSTA l'ESPERIMENTO?   Attività 1: clonaggio del gene per la proteina X e prove di espressione: si deve costruire un vettore (molecola di DNA circolare) da introdurre nelle cellule per produrre efficientemente la proteina X. Reagenti e strumentazione: Vettore; enzimi di restrizione; materiale per l’analisi elettroforetica del DNA; cellule competenti; soluzioni per la coltura di cellule competenti in locali adeguati; centrifughe; strumentazione per elettroforesi ed elettroporazione. Tempo: circa tre settimane Costo medio: 1.200 euro   Attività 2: messa a punto delle condizioni ottimali di espressione (si devono definire i ceppi cellulari per l’espressione, la temperatura, i tempi di crescita). Produzione su larga scala della proteina, la fattibilità e i costi della produzione dipendono dal tipo di cellule (procariotiche o eucariotiche) che si devono utilizzare. Reagenti e strumentazione: cellule competenti; soluzioni per la cultura di cellule competenti in locali adeguati. Tempo: da due settimane a diversi mesi. Costo medio: da 1000 euro a decine di migliaia di euro.   Attività 3: purificazione della proteina X tramite cromatografia (tecnica per la separazione dei componenti di una soluzione mista). Reagenti e strumentazione: colonna cromatografica e strumento HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione) Tempo: 1-2 settimane Costo medio: 3000 euro per la colonna (il costo dello strumento, invece, è di circa 30.000 euro), soluzioni e materiale vario di consumo 300 euro.   Attività 4: cristallizzazione della proteina X. La proteina purificata viene mescolata con centinaia di soluzioni diverse allo scopo di individuare le condizioni di crescita dei cristalli. Il mescolamento avviene grazie all’utilizzo di un “robot di cristallizzazione” che mescola in maniera precisa e controllata piccoli volumi (un decimo di milionesimo di litro) di proteina e di soluzioni di cristallizzazione. Solitamente i ricercatori effettuano almeno 300 prove diverse prima di ottenere la proteina cristallizzata, ma possono essere necessarie migliaia di prove per ottenere dei cristalli. Reagenti e strumentazione: Kit di soluzioni, piastre di cristallizzazione, robot di cristallizzazione Tempo: da un mese ad un anno. Costo medio: 1000 euro per proteine di media difficoltà (il costo dello strumento, invece, è di circa 80.000 euro).   Attività 5: raccolta dei dati di diffrazione di raggi-X al sincrotrone, analisi dei dati. Per saperne di più sul lavoro svolto al sincrotrone vedi i video: http://www.youtube.com/watch?v=p4DNQ391fGA http://www.youtube.com/watch?v=sL5X0_Xsq04 Tempo: 2-3 turni al sincrotrone dove i ricercatori lavorano per 24 ore consecutive e 3-6 mesi per l’analisi e l’interpretazione dei dati. Costo medio: 3.000 euro (sono incluse le spese del viaggio dei ricercatori per raggiungere il sincrotrone). Pubblicazione: 1.500 euro costi di editoria per la pubblicazione del lavoro.   Costo totale per l’esperimento: da circa 11000 euro a circa 50000 euro**, a seconda delle difficoltà poste dalla specifica proteina   * In Italia è presente il sincrotrone Elettra a Trieste e l’Italia partecipa come fondatore al sincrotrone europeo ESRF a Grenoble con una spesa annuale di 15 milioni di euro (European Synchrotron Radiation Facility). **I costi non includono quelli per la strumentazione base e la loro manutenzione. Non sono, inoltre, considerati i salari annuali per i ricercatori che conducono l’esperimento. Un esperimento di questo tipo è condotto in genere da tre ricercatori esperti (competenze richieste: biologia molecolare, biochimica e cristallografia). I salari si stabiliscono in base ai curricula.   Ringraziamenti: la Prof.ssa Beatrice Vallone (Dipartimento di Scienze Biochimiche “A. Rossi Fanelli”) ha fornito le informazioni necessarie alla stesura di questo articolo. Per saperne di più sulla ricerca condotta da Beatrice Vallone: Nuovi approcci per progettare agenti antimicrobici e Nuove strategie per ottimizzare la produzione di eritromicina.   CURIOSITA' Nel 2014 in tutto il mondo si celebra l’anno internazionale della cristallografia. Per informazioni: http://www.iycr2014.it Dal 1962, anno in cui Max Perutz e John Kendrew hanno vinto il Nobel per la struttura cristallografica di emoglobina e mioglobina, ben 8 premi Nobel tra medicina e chimica sono andati a studi di biologia strutturale che hanno usato la cristallografia (vedi http://www.iucr.org/people/nobel-prize).

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